Den antimikrobiella potentialen hos CRISPR-Cas-system är lovande, men hur man bäst designar eller implementerar CRISPR-nukleaser är fortfarande dåligt förstådd. Ett internationellt team under ledning av Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI) i Würzburg har nu åtgärdat denna kunskapslucka.
Forskarna har genomfört den första systematiska undersökningen av CRISPR-antimikrobiella medel med användning av multiresistenta och hypervirulenta bakterier som fallstudier, och avslöjade stora variationer i effekt som kunde förutsägas via screening med hög genomströmning och maskininlärning. Deras resultat publiceras i tidskriften Nucleic Acids Research .
Upptäckten av antimikrobiella föreningar som konventionella antibiotika har förändrat medicinen, vilket möjliggör behandling av infektioner som en gång ansågs obehandlade. Utvecklingen av nya medel har dock saktat ner, medan den felaktiga användningen av befintliga antibiotika har underblåst uppkomsten av antibiotikaresistens. Följaktligen finns det ett växande behov av nya metoder för att utrota patogener.
CRISPR-Cas-system, adaptiva immunmekanismer som bakterier använder för att försvara sig mot viral invasion, erbjuder en distinkt lösning genom sin förmåga att selektivt eliminera mikrober baserat enbart på genetiska sekvenser. Ändå har det hittills saknats systematiska studier för att bedöma effektiviteten av dessa CRISPR-antimikrobiella medel - särskilt över olika nukleaser, målplatser och bakteriestammar.
För att ta itu med denna lucka har ett internationellt team ledd av Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), en plats för Braunschweig Helmholtz Center for Infection Research (HZI) i samarbete med Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU), nu genomfört det första omfattande förhöret av dessa nya agenter. Deras forskning fokuserar på Klebsiella pneumoniae, en bakterie som är ökänd för sin koppling till antibiotikaresistens.
"Klebsiella pneumoniae erbjuder en särskilt övertygande fallstudie med tanke på att den omfattar många stammar med olika virulens- och resistensegenskaper", säger Chase Beisel, chef för RNA Synthetic Biology-avdelningen vid HIRI och professor vid JMU Medical Faculty. Han ledde den internationella studien i samarbete med forskare från Institut Pasteur i Paris, Frankrike, Tel Aviv University i Israel, HZI och University of Toronto i Kanada.
Teamet kombinerade expertis inom CRISPR-teknologier, Klebsiella-bakterier, bakteriofagleverans, skärmar med hög genomströmning och maskininlärning som behövs för att genomföra en studie i denna skala.
CRISPR-Cas-system använder en sofistikerad försvarsmekanism:En CRISPR-ribonukleinsyra (RNA) hjälper till att upptäcka regioner av ett främmande genom, såsom DNA eller RNA, för riktad klyvning. Därefter skär det CRISPR-associerade (Cas) nukleaset sitt mål som liknar en molekylär sax.
Forskarna fann att olika CRISPR-nukleaser uppvisar mycket varierande effektivitet. I sina experiment visade nukleaser inriktade på DNA överlägsen prestanda jämfört med de som fokuserade på RNA.
Dessutom visade olika typer av K. pneumoniae variation i deras känslighet för ett CRISPR-antimikrobiellt medel, trots att de använde identiska nukleaser för att rikta in sig på identiska platser. Elena Vialetto, studiens första författare och tidigare Ph.D. student i Beisel-labbet, säger:"Den varierande antimikrobiella aktiviteten mellan relaterade bakterier var överraskande med tanke på användningen av samma CRISPR-konstruktioner. Vi tillskrev denna skillnad till veckningen av CRISPR-RNA:n som styr DNA-inriktning."
Beisel tillägger, "Denna studie är den första som visar att den antibakteriella effektiviteten kan variera även mellan relaterade stammar."
För att utforska funktioner som kan förbättra inriktningen över olika stammar, genomförde forskarna en genomomfattande screening i olika typer av K. pneumoniae. Denna ansträngning gav designprinciper och parametrar för eventuella CRISPR-antimikrobiella medel och underlättade träningen av en algoritm för att förutse deras effektivitet.
Teamet tog sig också in i nästa steg av aktiv agentutveckling, nämligen leverans. Forskarna använde bakteriofager som vehiklar för CRISPR-antimikrobiella medel, som de utrustade med modifierade svansfibrer för att öka räckvidden för CRISPR-lasten.
Denna studie lägger grunden för vidareutvecklingen av CRISPR som ett sätt att förebygga eller behandla antibiotikaresistenta infektioner.
"Vi hoppas att detta arbete kommer att ge större synlighet för användningen av CRISPR som ett skräddarsytt antimikrobiellt medel i den pågående kampen mot antibiotikaresistens", avslutar Beisel.
Mer information: Elena Vialetto et al, Systematisk undersökning av CRISPR-antimikrobiella medel i Klebsiella pneumoniae avslöjar nukleas-, guide- och stamberoende egenskaper som påverkar antimikrobiell aktivitet, Nukleinsyraforskning (2024). DOI:10.1093/nar/gkae281
Journalinformation: Nukleinsyraforskning
Tillhandahålls av Helmholtz Center for Infection Research
