Inre membranproteiner (IMP) :Dessa proteiner är inbäddade i det inre membranet av E. coli, ett fosfolipid -tvåskikt som omsluter cytoplasma. De spelar avgörande roller i olika cellulära funktioner, inklusive:
* Transport: Underlättar rörelsen av näringsämnen, joner och avfallsprodukter över membranet.
* Signaltransduktion: Vidarebefordra signaler från miljön till cellens inre.
* Energimetabolism: Deltagande i processer som elektrontransport och ATP -syntes.
yttre membranproteiner (OMP) :Dessa proteiner är belägna i det yttre membranet av E. coli, ett andra fosfolipid -tvåskikt som omger det inre membranet och ger strukturellt stöd och skydd. De är involverade i:
* porinbildning: Skapa kanaler som tillåter passage av små molekyler.
* receptoraktivitet: Bindning till specifika molekyler och utlösande cellulära svar.
* vidhäftning: Fäst vid ytor eller andra celler.
Här är en allmän metod för att separera dessa proteintyper från E. coli:
1. Celllys:
* Mekanisk lysering: Använd metoder som sonikering eller fransk tryck för att störa cellväggen och släppa cellinnehållet.
* kemisk lysis: Använd tvättmedel som Triton X-100 eller SDS för att lösa upp membranlipiderna.
2. Differentialcentrifugering:
* låghastighetscentrifugering (10 000 x g): Detta steg tar bort cellavfall, inklusive obrutna celler och stora cellulära komponenter.
* Höghastighetscentrifugering (100 000 x g): Detta steg skiljer de inre och yttre membranen från den lösliga cytoplasma. Pelleten som innehåller båda membranen samlas in.
3. Membranfraktionering:
* sackarosgradientcentrifugering: Denna metod separerar membranen baserat på deras densitet. Det yttre membranet är vanligtvis mindre tätt än det inre membranet, vilket möjliggör deras separering.
* Triton X-114 Faspartitionering: Denna teknik använder ett nonjoniskt tvättmedel för att separera proteinerna baserat på deras hydrofobicitet. IMP:er är mer hydrofoba än omp, vilket leder till deras uppdelning i den tvättmedelsrika fasen.
4. Rening:
* affinitetskromatografi: Denna teknik använder specifika ligander som binder till målproteinet, vilket möjliggör dess separering från andra proteiner.
* jonbyteskromatografi: Denna metod separerar proteiner baserat på deras laddning.
* Storleksuteslutningskromatografi: Denna teknik separerar proteiner baserat på deras storlek.
5. Bekräftelse:
* SDS-PAGE: Denna elektrofores -teknik separerar proteiner baserat på deras molekylvikt.
* Western blotting: Denna teknik använder antikroppar för att detektera specifika proteiner.
Viktiga anteckningar:
* Det specifika protokollet beror på målproteinet och dess egenskaper.
* Optimering av varje steg är avgörande för att få rent och funktionellt protein.
* Tekniker som masspektrometri kan användas för ytterligare analys av de separerade proteinfraktionerna.
Kommersiella satser:
Flera kommersiella satser är tillgängliga för isolering av E. coli inre och yttre membranproteiner, vilket kan förenkla processen.
Genom att följa dessa steg och välja lämpliga tekniker kan forskare framgångsrikt separera och rena inre och yttre membranproteiner från E. coli, vilket möjliggör ytterligare analys av deras struktur, funktion och interaktioner.
