fotoquique/iStock/GettyImages
Molekylär kloning är en grundläggande teknik inom modern biologi som varje student och forskare bör behärska. Genom att använda restriktionsenzymer skär forskare dubbelsträngat DNA till hanterbara fragment som sedan kan infogas i en plasmidvektor och uttryckas i en bakterievärd.
Restriktionsenzymer är endonukleaser som binder specifika korta DNA-sekvenser, så kallade restriktionsställen, och klyver fosfodiester-ryggraden exakt i dessa positioner. Med över 90 distinkta enzymer katalogiserade, riktar sig var och en mot en unik sekvens och skär sin plats upp till 5 000 gånger snabbare än någon icke-igenkänd sekvens.
När ett restriktionsenzym skärs kan de resulterande ändarna vara antingen klibbiga ändar eller trubbiga ändar . Klibbiga ändar innehåller enkelsträngade överhäng som är komplementära till varandra; denna "klibbighet" driver snabb och specifik parning mellan två fragment. Trubbiga ändar har däremot perfekt parade strängar utan överhäng, vilket gör dem mindre selektiva under ligering.
Eftersom klibbiga ändar endast parar sig med sina komplementära överhäng, kan det infogade fragmentet komma in i plasmiden i en enda, definierad orientering. Trubbiga ändar erbjuder ingen sådan riktningskontroll, vilket gör att fragmentet kan ligera i antingen huvud-mot-svans- eller svans-mot-huvud-orientering.
Även om både klibbiga och trubbiga ändar i slutändan kräver DNA-ligas för att bilda en kontinuerlig sträng, minskar klibbiga ändar mängden DNA som behövs för en framgångsrik reaktion. Deras komplementära överhäng hittar varandra snabbare och mer effektivt, vilket gör att ligeringen kan fortsätta med lägre koncentrationer av inlägg och vektor.
Däremot måste trubbiga ändar enbart förlita sig på koncentrationen av DNA-molekyler för att kollidera och anpassa sig, vilket ofta kräver högre insatsmängder för att uppnå jämförbar ligeringseffektivitet.
En av de mest kraftfulla egenskaperna hos enzymer med sticky-end är att olika enzymer kan generera identiska överhäng, även om de känner igen distinkta sekvenser. Till exempel BamHI , BglII och Sau3A alla producerar samma 5'-GATC-3' klibbiga överhäng. Denna redundans ökar sannolikheten för att ett par lämpliga platser kommer att flankera en gen av intresse, vilket ger forskare flexibilitet att välja den optimala restriktionsstrategin.
Konstruerade plasmider kan också placera restriktionsställen intill varandra, vilket ytterligare förbättrar mångsidigheten hos kloningsdesigner.
