SolStock/E+/GettyImages
Cellmembran är sammansatta av fosfolipiddubbelskikt med inbäddade proteiner som förmedlar väsentliga cellulära funktioner. Traditionell ljusmikroskopi kan inte lösa enskilda membranproteiner. Frysfraktur, kombinerat med elektronmikroskopi, gör att vi kan dela frusna membran längs deras dubbelskikt, vilket exponerar proteinfördelningen i lipidmatrisen. Genom att integrera ytterligare märkningstekniker kan forskare kartlägga specifika proteiner, såväl som bakteriella och virala komponenter, med subnanometerprecision.
1. Frys snabbt celler eller vävnader i flytande kväve för att immobilisera strukturer.
2. Använd en mikrotom för att frakturera det frusna provet; membranet klyver mellan de två fosfolipidbladen där hydrofoba interaktioner är svagast.
3. Utför frysetsning i högvakuum för att ta bort iskristaller och bevara fina detaljer.
4. Skugga frakturytan med en tunn film av kol och platina för att skapa en stabil kopia som följer membrantopologin.
5. Smält kvarvarande organiskt material med syra och lämna ett platinaskal som representerar den exponerade membranytan.
6. Undersök replikan med transmissionselektronmikroskopi (TEM) för strukturell analys.
Frysetsning tar bort iskristaller som annars skulle skymma membrandetaljer. Vakuumtorkningsprocessen bevarar den ursprungliga arkitekturen och möjliggör observation av dynamiska membranaktiviteter, intracellulära organeller och virala sammansättningar.
Transmissionselektronmikroskopi erbjuder upp till 1 miljon gångers förstoring och upplösningar ner till 3nm, vilket gör den till den föredragna metoden för repliker med frysfraktur. Svepelektronmikroskopi (SEM) används mindre vanligt i detta sammanhang men kan ge yttopologi för större prover.
Sedan introduktionen för över fem decennier sedan, har frysfraktur-TEM varit avgörande för att bekräfta lipiddubbelskiktsmodellen av plasmamembranet och belysa det rumsliga arrangemanget av integrala, perifera och lipidförankrade proteiner. Tekniken avslöjar om proteiner är "floaters" som driver inom dubbelskiktet eller "ankare" som sträcker sig över båda broschyrerna, och den kan detektera proteinaggregation eller klustring. När de kombineras med immunogoldmärkning – antikroppar märkta med elektrontäta partiklar – kan forskare identifiera specifika proteiner och sluta sig till deras funktionella roller.
