Av John Brennan
Uppdaterad 24 mars 2022
Gelelektrofores förblir arbetshästen i molekylärbiologiska laboratorier. Genom att applicera ett elektriskt fält separeras DNA och proteiner – vanligtvis efter storlek – i en gelmatris. Även om tekniken är vanlig, varierar hur resultaten tolkas med nedströmsapplikationen, oavsett om det är en Western blot, Northern blot, Southern blot eller enkel agaroskörning.
När du arbetar med agarosgeler dominerar två uppgifter:1) särskilja oskurna, hackade och linjära plasmider från din insats, och 2) uppskatta fragmentstorlekar med hjälp av en pålitlig standardkurva. Följande steg leder dig genom den processen på ett tydligt, reproducerbart sätt.
Konsultera din labb-anteckningsbok för att bekräfta vilket prov som laddades i varje körfält. Filetiketterna som du registrerade vid tidpunkten för lastningen är din startpunkt för alla efterföljande beräkningar.
Stegen innehåller fragment av känd längd. Dess migreringsavstånd kommer att fungera som referens för storleken på dina okända band.
Använd en linjal och mät avståndet från brunnen till spårfärgen (färgämnet som går längst). Anteckna detta värde; enheterna är godtyckliga så länge de är konsekventa.
Mät varje stegbands avstånd från brunnen och dividera sedan med spårfärgningsavståndet. Detta ger den relativa rörligheten (mobilitetsfaktorn) för varje standard.
Exempel:Om spårningsfärgen färdades 6 tum och stegbanden färdades 5, 4,5 och 3,5 tum, är den relativa rörligheten 0,833, 0,75 och 0,583.
Ange de relativa rörligheterna och motsvarande fragmentstorlekar (i kilobaser) i ett kalkylblad. Tillverkare tillhandahåller vanligtvis dessa storlekar i stegens datablad.
Skapa en graf med relativ rörlighet på X-axeln och fragmentstorlek på Y-axeln.
Använd trendlinjefunktionen för att passa in en ekvation med maktlag (t.ex. y =ax^‑2). Sikta på en R² på minst 0,90 för att säkerställa en tillförlitlig kurva.
Mindre fragment migrerar längre. Observera att supercoiled (oskurna) plasmider färdas längre än linjära fragment av samma storlek, medan hackade plasmider migrerar långsammare.
Korsreferens varje banas band med provet du laddade. För en plasmid som smälts med två enzymer bör du se två distinkta band:ett nära toppen (insert) och ett nära botten (klippt plasmid). En enkel-enzym digerering bör producera ett enda band som färdas något längre än den oklippta plasmiden men mycket mindre än insättningen.
Mät avståndet från brunnen till varje okänt band, dividera med spårningsfärgämnesavståndet och få den relativa rörligheten.
Infoga de relativa rörligheterna i ekvationen som härleds i steg 7 för att beräkna den ungefärliga storleken på varje fragment.
Om du observerar breda, ljusa band nära botten av varje körfält, har du sannolikt RNA-kontamination – se över dina reningssteg.
