En av proteomikens viktigaste utmaningar, studier av alla proteiner uttryckta av en cell eller organism, skiljer mellan molekyler som är strukturellt olika men har samma massa. Detta är svårt eftersom en masspektrometer, huvudapparaten som används i denna typ av studier, fungerar som en vägningsvåg, sortera de analyserade molekylerna efter deras massa.

Ett sätt att minska förvirring vid användning av en masspektrometer är att börja med att överlämna provet till vätskekromatografi, som separerar hydrofila ("vattenälskande") proteiner från hydrofoba proteiner. De hydrofila proteinerna kommer först in i spektrometern, och de mest hydrofoba är kvar för det sista, minskar sannolikheten för att två olika molekyler med ekvivalenta massor kommer att tolkas som endast en av apparaten.

"Det är som att lösa ett pussel med miljontals bitar. När du först öppnar påsen, bitarna är alla blandade och överlappande. Du måste börja med att reda ut dem. När vi arbetar med proteomik, vi strävar ständigt efter att utveckla mer raffinerade sorteringstekniker, "sa Daniel Martins-de-Souza, som leder Neuroproteomics Laboratory vid University of Campinas (UNICAMP) i Brasilien.

I en studie med resultat som nyligen publicerades i Proteomik , Martins-de-Souzas grupp optimerade en metod för att öka upplösningen av proteomisk analys med masspektrometri. Tack vare en kombination av två andra tekniker-tvådimensionell vätskekromatografi och jonrörlighet-lyckades gruppen identifiera 10, 390 proteiner uttryckta i oligodendrocyter, centrala nervsystemets celler som är ansvariga för att producera myelin, en lipidsubstans som spelar en viktig roll i informationsutbytet mellan neuroner.

Med FAPESP -stöd, UNICAMP -gruppen har studerat den humana oligodendrocytproteomen i flera år, med syftet att bättre förstå orsakerna till schizofreni som grund för att föreslå nya terapeutiska tillvägagångssätt. "Vi har nu en mycket mer komplett oligodendrocytproteindatabas, som kommer att vara användbara för våra egna studier och för andra forskare inom området, "Martins-de-Souza sa." Det är tillgängligt online, och data kan laddas ner. Dessutom, optimeringstekniken kan användas för att studera proteomen i alla biologiska prov. "

I en tidigare studie med endimensionell vätskekromatografi för försortering, gruppen hade identifierat endast 2, 290 proteiner i oligodendrocyter.

Enligt Martins-de-Souza, för närvarande tillgängliga behandlingar för schizofreni med fokus på neuroner, men de neurala kommunikationsfel som observerats hos patienter kan bero på oligodendrocytdysfunktion. "En av våra forskningslinjer består i att utvärdera hur de läkemedel som används för att kontrollera schizofreni modifierar oligodendrocytproteomen, "sa han." Med denna nya metodik, vi kan få fem gånger mer information om dessa läkemedels roll. "

Studien genomfördes under den postdoktorala forskningen av Juliana Silva Cassoli och masterstudien av Caroline Brandão Teles, både med stipendier från FAPESP och handledning av Martins-de-Souza. Det första steget i proteomanalys med masspektrometri är att bryta ner proteinerna som extraheras från det biologiska provet av intresse, som i detta fall består av oligodendrocyter, i mindre partiklar som kallas peptider.

"Ett litet protein kan ge upphov till minst 10 olika peptider. Spektrometern är inte bra på att analysera hela molekylen på grund av dess stora storlek, "Förklarade Martins-de-Souza.

Nästa, gruppen överlämnade provet till separation genom kromatografi. Istället för att använda en enda matris, som i konventionell teknik, de använde två. I den första separationen, endast en femtedel av de injicerade peptiderna kom in i spektrometern i flytande form. Detta följdes av ytterligare en femtedel i den andra separationen, och så vidare.

"Det är som om du sprider ut pusselbitarna med båda händerna istället för bara en, "Sa Martins-de-Souza.

Inuti spektrometern, provet omvandlas till gas och flyger fram och tillbaka i vakuum. Ju mindre peptid, ju snabbare den når sin destination, och apparaten mäter sedan sin massa.

När molekylerna flyger omkring inuti spektrometern, jonmobilitetstekniken injicerar en liten mängd gas i apparaten genom ett rör.

"Motståndet som gasen erbjuds av molekylen beror på dess tredimensionella form, så om två olika peptider med samma massa flyger ihop och vi injicerar gasen i motsatt riktning, de tenderar att separeras med motståndskraften mot gasen. Det är som att plocka upp två pappersark med samma massa, skrynkla en till en boll, och släppa dem båda. På grund av dess form, det skrynkliga arket når golvet först, "Förklarade Martins-de-Souza.

I slutet av experimentet, mer än 223, 000 peptider som identifierats av spektrometern rekonstruerades med hjälp av bioinformatikverktyg, vilket resulterar i 10, 390 proteiner som beskrivs i tidningen. The group also used bioinformatics to map the cellular compartments in which the proteins are located and the biological processes in which they are involved.

"Helst, it should be possible to identify at least two peptides per protein. That way, we can be sure a molecule is really present in the sample, since two proteins with two exactly identical peptides are unlikely to occur. I den här studien, about 20% of the proteins were identified by more than 20 peptides, " Martins-de-Souza said.

The methodology enabled the researchers to identify even proteins that were relatively scarce in the sample, d.v.s. in quantities some 10 million times smaller than those of the most highly expressed molecules.

"One of the problems with mass spectrometry is that a very large piece of the jigsaw puzzle may hide several smaller ones. However, with an effective tool to spread out the pieces, you can see practically all of them, " Martins-de-Souza said.