En grupp kemister vid Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya universitet, har utvecklat ett nytt nära infrarött (NIR) sändande fotostabilt fluorescerande färgämne PREX 710 (fotoresistent xantenfärgämne som kan exciteras vid 710 nanometer) för att ha användningsområden som sträcker sig från långtidsbildning av en enda molekyl till in vivo djupbildning, enligt en studie som rapporterats i tidningen Angewandte Chemie International Edition .

PREX 710 har en molekylstruktur bestående av en fosfinoxid (P =O) -del i stället för syre i sin sammansmälta tricykliska xantenkärna, och 2 metoxigrupper (OMe) på den perifera aromatiska ringen, vilket gör att färgämnet kan absorbera och avge i NIR -regionen, och står för dess höga kemiska och fotostabilitet, respektive. Dessutom, PREX 710 NHS -estern kan kemiskt kopplas till biomolekyler inklusive proteiner, sockerarter, och små organiska ligander, vilket kan leda till observationer av olika strukturer och händelser i levande celler.

Tillsammans med forskarna vid RIKEN och Ehime University, teamet har funnit att PREX 710 kan användas för fluorescerande avbildning av en molekyl under fysiologiska förhållanden. Den höga fotostabiliteten hos PREX 710 möjliggör upprepad bildbehandling, och dess specifika egenskaper för ljusabsorption/utsläpp i NIR -regionen, tillåter mångfärgad avbildning med dess användning med andra fluorescerande färgämnen. Dessutom, genom att länka PREX 710 NHS -ester till en polysackarid (dextran), laget lyckades med 3D-djup in vivo-avbildning av blodkärl i mösshjärnor. Detta möjliggjordes av den höga kemiska stabiliteten för PREX 710 i blodströmmen, samt genom användning av NIR -strålning för att titta djupt inuti vävnaderna. Den höga fotostabiliteten, vattenlöslighet och kemisk stabilitet, tillsammans med dess låga cytotoxicitet, och användning av NIR -strålning gör PREX 710 till ett kraftfullt verktyg för att visualisera molekylära processer och strukturer för lång varaktighet utan fotoblekning inuti levande organismer.

Fluorescensavbildning är en teknik där ett specifikt protein eller cellorganell är märkt med en fluorescerande sond och används för att visualisera processer och strukturer av organismer under ett fluorescerande mikroskop. Även om många fluorescerande märkningsmedel, såsom fluorescerande proteiner och små fluorescerande organiska molekyler har utvecklats hittills, de flesta av dem använder strålning i det synliga området. Nackdelarna med att använda synligt ljus som blått eller grönt ljus beror på dess höga energi, som kan orsaka skador på levande prover när de utsätts för långa perioder. Dessutom, när proverna exciteras med synligt ljus, autofluorescens från själva proverna tenderar att störa signalerna från de fluorescerande sonderna. Det är också känt att biomolekyler som hemoglobin tenderar att absorbera synligt ljus, så att ljuset inte når djupt inuti organismerna, som har gjort är svårt att visualisera levande blodkärl och organ.

Dessa problem som uppstår vid avbildning med synligt ljus kan övervinnas med NIR -strålning, som har en längre våglängd, alltså lägre energi, jämfört med synligt ljus. Ändå, många av de NIR -färgämnen som utvecklats hittills är baserade på cyaninfärger, som består av polymetinkedjor (metin (CH) -grupper anslutna genom alternerande enkel- och dubbelbindningar) som har kväveinnehållande heterocykler fästa vid varje ände av kedjan. Majoriteten av cyaninfärgämnena lider av låg kemikalie och fotostabilitet, vilket försvårar långsiktig biobildning med dessa färgämnen på grund av fotoblekning över tid. Även om anti-blekningsmedel kan läggas till för att förhindra fotoblekning, de kanske inte är tillämpliga i experiment med levande celler.

"Yamaguchi -gruppen har varit intresserade av att göra fotostabila färgämnen för biobildning som absorberar och avger i olika våglängder, "säger Dr Masayasu Taki, docent i professor Shigehiro Yamaguchis grupp vid ITbM, och en av ledarna för denna studie. "Det är känt att excitations- och emissionsvåglängderna för färgämnen ökar med en ökning av konjugerade dubbelbindningar i dess struktur, men fler ringar gör syntesen komplicerad och leder också till låg vattenlöslighet, som inte är idealisk för avbildning under fysiologiska förhållanden. Vi bestämde oss därför för att syntetisera olika färgämnen genom att ändra elementen på kärn xantenringen från syre till fosfor. "

"Dr Marek Grzybowski, en postdoktor i vår grupp, har arbetat med detta projekt, och har utvecklat synteserna för många av de rhodaminbaserade fluorescerande färgämnena som nyligen utvecklats i vår grupp, "beskriver Taki.

Under sina studier, gruppen fann också att ett av derivaten av PREX 710 var mottagligt för attacker mot en reducerad form av glutation (GSH), som är en tripeptid som fungerar som en antioxidant i celler. Även om avfärgning av färgämnen med GSH allmänt anses vara en nackdel med fluorescerande levande avbildning, gruppen ansåg att detta färgämne kunde fungera som en lovande NIR -sond för att övervaka GSH -nivån i levande celler och vävnader.

"Efter att ha syntetiserat och testat olika xantenderivat, vi hittade PREX 710, som uppvisade exceptionell kemikalie och fotostabilitet, och visade sig således vara en praktisk NIR-emissiv fluorofor, som i sig är membrangenomsläpplig och huvudsakligen lokaliseras i mitokondrier hos levande HeLa-celler, "förklarar Taki." Vi var väldigt glada över att se det med PREX 710, vi kunde visualisera levande cellkomponenter i många minuter jämfört med bara några sekunder som kunde uppnås med konventionella färgämnen. "

I samarbete med Dr Yasushi Okada, en teamledare vid RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, teamet fann att PREX 710 var tillämplig för fluorescerande avbildning med en molekyl, en teknik som är känd för att kräva stark ljusstrålning. Deras studier visar att under samma experimentella förhållanden, 80% av fluorescerande signaler från enmolekylen från PREX 710 kunde detekteras i 2 minuter, medan hälften av signalerna försvann inom 20 sekunder med Alexa Fluor 647 (cyaninfärgämne). Experimenten visar att PREX 710 tydligt kan visualisera varje enskild molekyl under långa perioder utan fotoblekning i frånvaro av anti-blekningsmedel.

Dessutom, teamet kunde använda PREX 710 vid mångfärg avbildning av levande HeLa -celler. Eftersom NIR -excitations- och emissionsegenskaperna för PREX 710 skiljer sig från fluorescerande färgämnen i synligt ljus, spektral överhörning kan undvikas för att visualisera cellkomponenter som var och en är färgade med olika färgämnen. Till exempel, flerfärgad avbildning av levande HeLa -celler var möjlig vid färgning av cellmembranet, kärna och mitokondrier med kommersiellt tillgängliga fluorescerande färgämnen som DiI och SiR-DNA, tillsammans med PREX 710, respektive.

Den praktiska användbarheten av PREX 710 demonstrerades också genom att applicera sonden för djupavbildning in vivo, som genomfördes i samarbete med Dr. Takeshi Imamura och Ryosuke Kawakami från Ehime University. Med hjälp av biokonjugeringsstället för PREX 710, dextran, en polysackarid som består av glukosmolekyler, märktes fluorescerande och injicerades i blodomloppet via musens svansven. 3D-bilden av blodkärl i mushjärnan kan konstrueras på grund av den höga ljusstyrkan för PREX 710 i NIR-regionen som möjliggör registrering av fluorescenssignaler i djup vävnad.

"Vi var glada att visa att PREX 710 och dess derivat är användbara verktyg för att undersöka dynamiken hos levande organismer, vävnader, celler, och molekyler, "säger Taki." Vi arbetar för närvarande med att utveckla andra NIR -fluorescensprober som kan användas för färgning av specifika proteiner samt för att undersöka levande strukturer och processer mer djupgående. Vi hoppas att detta kommer att leda till visualisering och belysning av olika fenomen i levande system, inklusive medicinska symptom, " han säger.