Variant tdfJ gener uttrycks från ett inducerbart ektopiskt ställe i gonokockkromosomen. Vildtyps- och muterade former av tdfJ klonades in i en komplementeringsvektor utformad för att infoga i ett ektopiskt ställe av gonokockskromosomen mellan aspC- och lctP-loki. Denna konstruktion innehåller en IPTG-inducerbar promotor och ett starkt ribosombindande ställe uppströms om den insatta genen. (A) Schematisk som visar den slutliga genotypen av gonokock-tdfJ-mutanter. Plasmider innehållande antingen vildtyp eller muterad tdfJ användes för att transformera N. gonorrhoeae-stam FA19 med dess naturliga tdfJ-lokus inaktiverat av en omega-kassett, vilket resulterade i gonokocker som endast producerar TdfJ under induktion. (B) Gonokock-tdfJ-mutanter odlade på GCB-agarplattor med (+) och utan (-) 1 mM IPTG återsuspenderades i PBS. Cellsuspensioner standardiserades och användes för att framställa cellysat, som var Western blotted (WB) för att bedöma TdfJ-produktion och IPTG-kontrollen. En sann vildtypsstam, FA19, och dess isogena tdfJ-mutant odlades under zinkbegränsade förhållanden för att fungera som positiva och negativa kontroller. Ponceau-färgning (P.S.) av blottarna visas också visa lika belastning. ("FA19 WT" hänvisar till den sanna vildtypsstammen som uttrycker tdfJ från dess ursprungliga locus; "WT" hänvisar till vildtyps tdfJ-genen i det inducerbara ektopiska stället; och "ΔL3H" hänvisar till en deletionsmutant i tdfJ, som saknar 15 aminosyror från loop 3 α-helix.) Blotten är representativ för resultat från 3 experiment. Kredit:mBio (2022). DOI:10.1128/mbio.01670-22
Att skapa en mutation som hämmar hur den bakteriella patogenen Neisseria gonorrhoeae orsakar gonorré, en vanlig sexuellt överförbar infektion, skulle kunna erbjuda ett nytt sätt att förebygga och behandla sjukdomen, enligt forskare vid Institutet för biomedicinska vetenskaper vid Georgia State University.
Forskarna fann att generering av en mutation i en nyckeldel av den yttre membrantransportören som N. gonorrhoeae använder för att kapa mänskliga immunitetsproteiner och ta bort dem från metaller kan hjälpa till att förhindra gonorréinfektion. Resultaten publiceras i tidskriften mBio .
Gonorré, som drabbar mer än 80 miljoner människor över hela världen varje år, är ett globalt hot mot folkhälsan på grund av den ökande förekomsten av antimikrobiell läkemedelsresistens, stigande behandlingskostnader och bristen på ett skyddande vaccin. Upp till 80 procent av fallen hos kvinnor är asymtomatiska, och om den lämnas obehandlad kan gonorré leda till allvarliga hälsokonsekvenser, inklusive bäckeninflammatorisk sjukdom, utomkvedshavandeskap, infertilitet och till och med livshotande endokardit och hjärnhinneinflammation.
Effektiva behandlingsalternativ för gonorré minskar på grund av utvecklande antimikrobiell resistens mot befintliga läkemedel. Det är också utmanande att identifiera lämpliga vaccinmål eftersom N. gonorrhoeae förändrar uttrycket av viktiga ytmolekyler och dämpar immunsvaret. För att blockera invaderande patogener från att orsaka sjukdom, förlitar sig människor på en process som kallas näringsimmunitet för att begränsa tillgången på viktiga näringsämnen som järn och zink och svälta inkräktare. Metallbindande proteiner binder metaller och begränsar mängden fria essentiella metalljoner som patogener behöver för att blomstra och orsaka sjukdomar.
För att övervinna värdns näringsimmunitetsförsök använder N. gonorrhoeae TonB-beroende transportörer (TdTs) till sitt yttre membran för att binda till värdens näringsmässiga immunitetsproteiner och ta bort dem från deras metaller. TdT spelar ofta nyckelroller för att etablera infektioner, vilket gör dem till lovande vaccinmål.
En TdT som heter TdfJ känner igen human S100A7, ett zinkbindande protein som hämmar replikeringen av patogener genom att dölja zink. N. gonorrhoeae använder TdfJ för att extrahera zink från S100A7 och internalisera metallen. TdfJ innehåller ett alfa-helixfinger i extracellulär loop 3.
En liknande alfa-helix i loop 3 av en annan gonokocker TdT, känd som TbpA, spelar en avgörande roll i interaktionen mellan TbpA och humant transferrin, vilket krävs för upptaget av järn. Baserat på denna information antog forskarna att TdfJ loop 3 helix (L3H) deltar i interaktioner med S100A7, och de genererade en serie mutationer i TdfJ L3H för att avgöra om de blockerade förmågan hos N. gonorrhoeae att förvärva zink och därför att orsaka sjukdom.
"Utsikten till obehandlade gonokockinfektioner har stimulerat ansträngningar för att identifiera mål för nya terapeutiska och förebyggande strategier, och medlemmar av familjen av yttermembranet TonB-beroende metalltransportörer har framstått som lovande kandidater eftersom de spelar en avgörande roll för att etablera infektion," sa Dr. Cynthia Nau Cornelissen, senior författare till studien, framstående universitetsprofessor och chef för Center for Translational Immunology vid Institutet för biomedicinska vetenskaper i Georgia State.
"Vår studie avslöjade att mutagenes av nyckelrester inom TdfJ L3H minskade S100A7-bindningen och zinkpiratverksamheten av gonokocken, med de mest djupgående effekterna sett med substitutioner vid resterna K261 och R262. Sammantaget antyder dessa data en nyckelroll för TdfJ L3H för att undergräva värdens näringsimmunitet."
Studien karakteriserade den bindande interaktionen mellan zinkimportören TdfJ och dess humana zinkkälla, S100A7, och den identifierade också en nyckelregion av TdfJ som förmedlar denna interaktion.
"Vi detaljerade för första gången bindningsinteraktionen för gonokock TdfJ och dess humana ligand S100A7. Vi identifierade också flera mutationer i TdfJ loop 3 som förändrar S100A7-bindning och efterföljande zinkextraktion", säger Stavros A. Maurakis, första författare till studien och en Ph.D. examen från Institute for Biomedical Sciences i Georgia State.
"Med en mer grundlig förståelse av de intrikata relationerna mellan dessa bakteriella näringsreceptorer och deras värdnäringskällor, kan vi hjälpa till att bana väg mot att identifiera effektiv profylax och/eller behandling för en viktig mänsklig sjukdom." + Utforska vidare
