En ny variant av CRISPR-Cas9-genredigeringssystemet gör det lättare att omkonstruera enorma mängder celler för terapeutiska tillämpningar. Tillvägagångssättet, som utvecklats vid Gladstone Institutes och UC San Francisco (UCSF), låter forskare introducera särskilt långa DNA-sekvenser till exakta platser i genomet av celler med anmärkningsvärt hög effektivitet utan de virala leveranssystemen som traditionellt har använts för att bära DNA in i celler.

"Ett av våra mål under många år har varit att sätta långa DNA-instruktioner på en riktad plats i genomet på ett sätt som inte är beroende av virala vektorer", säger Alex Marson, MD, Ph.D., chef för Gladstone -UCSF Institute of Genomic Immunology och senior författare till den nya studien. "Detta är ett stort steg mot nästa generation av säkra och effektiva cellterapier."

I den nya artikeln publicerad i tidskriften Nature Biotechnology , beskriver Marson och hans kollegor inte bara tekniken utan visar hur den kan användas för att generera CAR-T-celler med potential att bekämpa multipelt myelom, en blodcancer, samt för att skriva om gensekvenser där mutationer kan leda till sällsynt ärftligt immunförsvar sjukdomar.

"Vi visade att vi kan konstruera mer än en miljard celler i en enda körning, vilket är långt över antalet celler vi behöver för att behandla en enskild patient", säger första författaren Brian Shy, MD, Ph.D., en klinisk fellow i Marsons labb.

Från dubbel- till enkelsträngat DNA

CRISPR-Cas9, ett system som redigerar gener inuti levande celler, har använts som ett grundläggande forskningsverktyg under det senaste decenniet. I allt högre grad är många kliniker forskare entusiastiska över potentialen hos CRISPR-Cas9 för att generera levande cellterapier.

Med genredigering kan man bland annat stänga av, ta bort eller ersätta en muterad, sjukdomsframkallande gen, eller stärka den cancerbekämpande aktiviteten hos en immuncell. Även om de första terapeutiska tillämpningarna av CRISPR-Cas9 nyligen har påbörjat kliniska prövningar, har teknologin fortfarande begränsats av utmaningen att på ett säkert sätt tillverka stora mängder korrekt redigerade celler.

Traditionellt har forskare förlitat sig på virala vektorer - skalen av virus utan deras sjukdomsframkallande komponenter - för att bära DNA (kallad DNA-mall) som används för genterapi in i celler. Tillverkning av bulkmängder av virala vektorer av klinisk kvalitet har dock varit en stor flaskhals för att få cellterapier till patienter. Dessutom kan forskare inte enkelt kontrollera var traditionella virala vektorer infogar gener i genomet.

"Att använda virala vektorer är dyrt och resurskrävande", säger Shy. "En stor fördel med en icke-viral metod för genteknik är att vi inte är lika begränsade av kostnader, tillverkningskomplexitet och utmaningar i leveranskedjan."

År 2015 visade Marsons grupp – i samarbete med labbet av CRISPR-pionjären Jennifer Doudna, Ph.D. – att de kunde infoga korta DNA-mallar i immunceller utan virusvektorer, med hjälp av ett elektriskt fält som gör cellernas yttre membran mer permeabla . År 2018 utvecklade de en metod för att klippa och klistra in längre DNA-sekvenser i immunceller med CRISPR och publicerade den i Nature .

Sedan, 2019, upptäckte forskarna att genom att även använda en modifierad version av DNA-mallarna som kan binda till Cas9-enzymet – samma protein som fungerar som molekylär sax under CRISPR-genredigering – kunde de leverera de nya sekvenserna till det målinriktade genomet webbplatsen mer effektivt. Det verket publicerades i Nature Biotechnology .

Mer arbete krävdes dock för att förbättra utbytet av framgångsrikt konstruerade immunceller och för att göra processen kompatibel med tillverkningen av framtida cellterapier. Dessa mål motiverade lagets aktuella studie.

DNA kan existera i enkel- eller dubbelsträngar (som motsatta bitar av kardborreband), och Cas9 fäster till dubbelsträngat DNA. Forskarna upptäckte snabbt att höga nivåer av dubbelsträngad DNA-mall kan vara giftig för celler, så metoden kunde endast användas med låga mängder mall-DNA, vilket leder till låg effektivitet.

Teamet visste att enkelsträngat DNA var mindre giftigt för celler, även vid relativt höga koncentrationer. Så i den nya artikeln beskriver de en metod för att fästa det modifierade Cas9-enzymet till ett enkelsträngat mall-DNA, genom att bara lägga till ett litet överhäng av dubbelsträngat DNA i ändarna.

"Detta ger oss en balanserad strategi som är bäst av båda världarna", säger Marson.

Enkelsträngat mall-DNA kunde mer än fördubbla effektiviteten av genredigering jämfört med den äldre, dubbelsträngade metoden. Och de dubbelsträngade ändarna av molekylerna låter forskare använda Cas9 för att förbättra leveransen av icke-virala vektorer till celler.

"Denna teknik har potential att göra nya cell- och genterapier snabbare, bättre och billigare", säger Jonathan Esensten, MD, Ph.D., en författare till det nya verket som är biträdande professor i laboratoriemedicin vid UCSF och en affiliate utredare på Gladstone.

En väg till kliniken

I studien använde forskarna den nya DNA-mallen för att generera mer än en miljard CAR-T-celler som riktar sig mot multipelt myelom. CAR-T-celler är immun-T-celler genetiskt modifierade för att effektivt bekämpa specifika celler eller cancer. Med de nya enkelsträngade, Cas9-riktade mallarna fick ungefär hälften av alla T-celler den nya genen och, som ett resultat, omvandlades till CAR-T-celler.

"Vi visste att att rikta DNA-mallarna till en specifik plats i genomet, kallad TRAC-platsen, skulle förbättra antitumörstyrkan hos CAR-T-celler", säger Justin Eyquem, Ph.D., en medförfattare till new paper, biträdande professor i medicin vid avdelningen för hematologi och onkologi vid UCSF, och affiliate utredare vid Gladstone. "Detta nya icke-virala tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att uppnå detta mål mycket mer effektivt, vilket kommer att påskynda utvecklingen av nästa generation av CAR-T-cellterapier."

Dessutom visade forskarna att deras tillvägagångssätt för första gången i sin helhet kunde ersätta två gener associerade med sällsynta genetiska immunsjukdomar, IL2RA- och CTLA4-generna.

Tidigare har forskare visat att de kan ersätta små delar av IL2RA-genen där vissa patienter har mutationer. Nu bevisade Marsons team att de kan ersätta hela IL2RA- och CTLA4-generna på en gång - en "one size fits all"-metod som kan behandla många patienter med olika mutationer i dessa gener, snarare än att behöva generera personliga mallar för varje patients mutation. Nästan 90 procent av cellerna som behandlats med denna genteknik har fått de friska versionerna av generna.

Forskarna söker nu godkännande för att avancera kliniska prövningar med icke-viral CRISPR-teknologi i både CAR-T-cellterapi och behandling av IL2RA-brist. + Utforska vidare

Studien uppmuntrar till ett försiktigt förhållningssätt till CRISPR-terapi