Metoder för att erhålla encellskloner
1. Utspädningskloning (begränsad utspädning)
- princip: Utspädning av cellsuspensionen till en tillräckligt låg koncentration för att enskilda celler separeras och pläteras i enskilda brunnar eller fläckar.
- Förfarande:
- 1. Förberedelse: Bestäm den ungefärliga cellkoncentrationen för din kultur med hjälp av en hemocytometer eller cellräknare.
- 2. Utspädning: Beräkna utspädningsfaktorn som behövs för att uppnå en önskad celltäthet (t.ex. 1 cell per brunn). Späd din cellupphängning i enlighet därmed.
- 3. Plätering: Platta de utspädda cellerna i en platta med flera brunnar (96-brunnar, 24-brunnar, etc.) eller på en petriskål.
- 4. Inkubation: Låt cellerna växa och bilda kolonier.
- 5. Val: Identifiera brunnar eller områden med enstaka kolonier (en cell gav upphov till hela kolonin).
2. Micromanipulation (MicroScopic Selection)
- princip: Använd ett mikroskop och en mikromanipulator för att fysiskt plocka upp en enda cell och överföra den till ett nytt tillväxtmedium.
- Förfarande:
- 1. Förberedelse: Använd ett mikroskop med en mikromanipulator.
- 2. Cellval: Identifiera en enda cell av intresse under mikroskopet.
- 3. Isolering: Använd noggrant mikromanipulatorn för att plocka upp cellen.
- 4. Överföring: Överför cellen till ett nytt tillväxtmedium (t.ex. en liten odlingsrätt eller en mikrotube).
- 5. Inkubation: Låt cellen växa till en koloni.
3. Flödescytometribaserad sortering
- princip: Med hjälp av en flödescytometer för att sortera celler baserade på specifika egenskaper (t.ex. storlek, fluorescens).
- Förfarande:
- 1. Märkning: Etikettceller med fluorescerande markörer för att skilja dem från andra från andra.
- 2. Sortering: Kör cellsuspensionen genom flödescytometern. Instrumentet analyserar och separerar celler baserat på de angivna parametrarna.
- 3. Samling: Samla in celler av intresse i ett nytt tillväxtmedium.
- 4. Inkubation: Låt cellerna växa till kolonier.
Överväganden för kloning med encell
* celltyp: Olika celltyper har olika tillväxtegenskaper. Vissa är mer känsliga för isolering än andra.
* tillväxtmedium: Valet av odlingsmedium är avgörande för att stödja encellstillväxt.
* Clone Purity: Se till att de valda kolonierna härstammar från en enda cell.
* Tid: Kloning kan ta tid, eftersom enstaka celler måste multiplicera i en koloni.
* Applikationer:
- cellinjeutveckling: Skapa rena cellinjer med specifika egenskaper.
- drogscreening: Testa läkemedelseffekter på enskilda celler.
- genetisk forskning: Studera genuttryck och mutationer på encellsnivå.
Låt mig veta om du vill ha mer information om någon av dessa metoder eller har frågor om specifika applikationer!
