Comstock/Comstock/Getty Images
Innan DNA kan sekvenseras eller redigeras måste forskarna först isolera det från cellmatrisen. Även om celler innehåller en blandning av proteiner, lipider, kolhydrater och små molekyler, gör DNA:s unika kemiska egenskaper att det kan separeras och renas för nedströmsanalys.
Det första steget i varje arbetsflöde för DNA-extraktion är cellys. Beroende på provtyp och önskad renhet väljer laboratorier mellan mekaniska, enzymatiska eller tvättmedelsbaserade metoder. Rengöringsmedel solubiliserar cellulära membran, högfrekventa ultraljudsvågor (sonikering) stör membran genom kavitation och pärlslag – där glaspärlor vibrerar mot provet – ger en snabb, fysisk störning som frisätter nukleinsyror.
När hastigheten överväger renhet, använder forskare ibland en minimal rengöring. Tillsats av proteinaseK bryter ned majoriteten av proteinerna, vilket gör att provet kan användas med endast mild rening. Alternativt fäller höga saltkoncentrationer (t.ex. ammonium- eller kaliumacetat) ut proteiner, men många andra föroreningar finns kvar. Dessa metoder är lämpliga för snabb screening men är olämpliga för tillämpningar som kräver högkvalitativt DNA.
Fenol-kloroformextraktion förblir en klassisk teknik, även om den nu är mindre vanlig på grund av toxicitet och arbetsintensitet. Celler lyseras med tvättmedel och blandas sedan med en blandning av fenol:kloroform:isoamylalkohol. Vid centrifugering separeras lösningen i en vattenfas (botten) som behåller DNA och en organisk fas (överst) som fångar upp proteiner och lipider. Noggrann kontroll av saltkoncentration och pH är avgörande för optimal återhämtning. Eftersom fenol och kloroform är farliga, har många laboratorier gått över till säkrare alternativ.
Anjonbyteskromatografi erbjuder högre renhet och reproducerbarhet. Kolonnmatrisen innehåller positivt laddade grupper som binder negativt laddat DNA. Proteiner, RNA och andra föroreningar tvättas bort, och DNA elueras därefter med en buffert med hög salthalt. Denna metod är särskilt värdefull för preparativ rening.
Kiselbaserade spin-kolonnkit har blivit guldstandarden för snabb, reproducerbar DNA-rening. DNA binder till ett kiselmembran i närvaro av kaotropa salter, medan föroreningar tvättas bort. Efter en sista sköljning med låg salthalt elueras DNA i en liten volym TE eller vatten, vilket ger material av hög kvalitet på några minuter.
Efter isolering placeras DNA-lösningen vanligtvis i en pH-kontrollerad buffert. Dess renhet verifieras genom att mäta ultraviolett absorbans vid 260nm och 280nm. Ett 260/280 förhållande på ~1,8 indikerar hög renhet, medan lägre förhållanden tyder på proteinkontamination. Absorbans vid 260 nm ger också en enkel uppskattning av DNA-koncentrationen.
