Thinkstock/Stockbyte/Getty Images
Att bestämma koncentrationen av mikrober i ett prov är avgörande för kvalitetskontroll i laboratorier, livsmedelssäkerhet och miljöövervakning. En beprövad metod är att utföra serieutspädningar, stryka provet på agar, inkubera och räkna de resulterande kolonierna. Varje koloni uppstår från en kolonibildande enhet (CFU) – en enda cell eller ett kluster som kan replikera på tillväxtmediet. Genom att räkna kolonier på plattor som innehåller mellan 30 och 300 kolonier kan forskare beräkna den mikrobiella belastningen med tillförsikt.
Att helt enkelt sprida ett råprov på en agarplatta kommer att producera en sammanflytande gräsmatta av kolonier, vilket gör enskilda kolonier omöjliga att särskilja. För att undvika detta, suspendera först provet i ett flytande medium och utför sedan en serie om 6–10 serieutspädningar. Vanligtvis stryks 0,1 ml av varje utspädning på en färsk agaryta, sprids jämnt och inkuberas vid lämplig temperatur i 4–7 dagar. Inkubationsperioden tillåter varje CFU att växa till en synlig, räknebar koloni.
Manuell räkning kräver noggrann teknik. Placera petriskålen på ett genomskinligt rutnät eller överlägg och räkna kolonier i varje cell i följd. Att markera baksidan av fatet eller använda ett tallysystem förhindrar dubbelräkning. För robust statistik, räkna minst tre plattor per spädning och kassera plattor som faller utanför intervallet 30–300 kolonier; sådana plattor indikerar över- eller underutspädning och måste pläteras om.
För att minska mänskliga fel och öka genomströmningen, fångar automatiserade koloniräknare en högupplöst bild av plattan, segmenterar kolonierna från bakgrunden och tillämpar bildanalysalgoritmer för att räkna kolonierna. Även om den här tekniken förbättrar hastigheten och konsistensen, kan den kämpa för att separera kolonier som rör vid kanterna, en begränsning som fortsätter att driva programvaruförbättringar.
Kolonibildande enheter kan bestå av enstaka celler, kedjor eller klumpar; sålunda kan antagandet att en koloni är lika med en cell underskatta verklig mikrobiell täthet. Dessutom kommer endast organismer som trivs under de valda medierna och inkubationsförhållandena att bilda kolonier, så metoden kan missa livsdugliga men icke-odlingsbara celler. Slutligen tar koloniantal inte hänsyn till döda celler som finns i det ursprungliga provet.
