Av Dianne Hermance, uppdaterad 30 augusti 2022
Gelelektrofores är en hörnstensteknik inom molekylärbiologi som separerar nukleinsyror och proteiner baserat på storlek och laddning. Genom att applicera ett elektriskt fält över en gelmatris, migrerar laddade molekyler med hastigheter omvänt proportionella mot deras längd, vilket möjliggör en exakt storleksuppskattning.
Det vanligaste mediet är agaros, en renad polysackarid som härrör från tång. Agaros bildar ett poröst nätverk som tillåter molekyler av olika storlekar att passera med olika hastigheter. För fragment mindre än ~200 bp erbjuder en polyakrylamidgel högre upplösning, även om den kräver noggrann hantering på grund av dess neurotoxiska egenskaper.
Innan gellösningen hälls blandas den med ett interkalerande färgämne - traditionellt etidiumbromid (EtBr) - som fluorescerar under UV-belysning när det binds till DNA. Moderna protokoll använder alltmer säkrare alternativ som SYBRSafe eller GelRed, om än till en högre kostnad.
Under gelgjutning skapar en kam brunnar som senare fylls med prov blandat med ett laddningsfärgämne. Färgämnet spårar provets framsteg och lägger till densitet för att förhindra diffusion.
När gelén stelnar sänks den ned i en kompatibel löpbuffert. Brunnarna laddas med DNA- eller proteinprover och en DNA-stege – en uppsättning fragment med kända storlekar – placeras i en referensbrunn. En konstant spänning (vanligtvis 80–120V) driver de negativt laddade molekylerna mot den positiva elektroden.
Efter elektrofores exponeras gelén för en UV-transilluminator. Band som motsvarar DNA eller RNA fluorescerar; proteinband kan visualiseras med Coomassie- eller silverfärgning. Migrationsavståndet för varje band jämförs med stegen för att härleda fragmentstorlekar, medan bandintensiteten indikerar relativ koncentration.
Noggrann hantering av EtBr eller dess alternativ är väsentlig, eftersom dessa föreningar kan interkaleras i DNA och, i fallet med EtBr, anses vara mutagena.
Högkvalitativa resultat beror på noggrann gelberedning:med nyberedda, RNase-fria buffertar; säkerställa enhetlig geltjocklek; och undvika korskontaminering mellan prover. Rena, välupplösta band fria från smetning indikerar framgångsrik separation och noggranna nedströmsanalyser.
Gelelektrofores stödjer ett brett spektrum av tillämpningar – från DNA-fingeravtryck inom kriminalteknik till bedömning av PCR-produkter, kloning av fragment och verifiering av proteinrenhet. Tillförlitlig tolkning av elektroforetiska data är därför avgörande för både forskning och klinisk diagnostik.
