Genom år av konstruktion av genredigeringssystem har forskare utvecklat en uppsättning verktyg som möjliggör modifiering av genom i levande celler, liknande "genomkirurgi". Dessa verktyg, inklusive de som är baserade på ett naturligt system som kallas CRISPR/Cas9, erbjuder enorm potential för att tillgodose otillfredsställda kliniska behov, vilket understryks av det nyligen godkända FDA-godkännandet av den första CRISPR/Cas9-baserade behandlingen.
En relativt ny metod som kallas "prime editing" möjliggör genredigering med exceptionell noggrannhet och hög mångsidighet, men har en kritisk kompromiss:variabel och ofta låg effektivitet i redigeringsinstallationen. Med andra ord, även om prime-redigeringar kan göras med hög precision och få oönskade biprodukter, misslyckas metoden ofta med att göra dessa redigeringar med rimliga frekvenser.
I en tidning som förekom i tryck i tidskriften Nature den 18 april 2024 beskriver Princeton-forskarna Jun Yan och Britt Adamson, tillsammans med flera kollegor, en mer effektiv huvudredaktör.
Prime-redigeringssystem består minimalt av två komponenter:en modifierad version av proteinelementet i CRISPR/Cas9 och en ribonukleinsyra (RNA)-molekyl som kallas pegRNA. Dessa komponenter arbetar tillsammans i flera koordinerade steg:Först binder pegRNA proteinet och leder det resulterande komplexet till en önskad plats i genomet.
Där hackar proteinet DNA:t och, med hjälp av en mallsekvens kodad på pegRNA:t, "omvänd transkriberar" en redigering till genomet i närheten. På detta sätt "skriver" prime editors exakta sekvenser in i mål-DNA.
"Prime-redigering är ett så otroligt kraftfullt genomredigeringsverktyg eftersom det ger oss mer kontroll över exakt hur genomiska sekvenser förändras," sa Adamson.
I början av sin studie resonerade Adamson och Yan, en doktorand i Adamsons forskargrupp och Institutionen för molekylärbiologi, att okända cellulära processer kan hjälpa eller hindra prime-redigering. För att identifiera sådana processer lade Yan fram en konceptuellt enkel plan:Först skulle han konstruera en cellinje som skulle avge grön fluorescens när vissa prime-redigeringar installerades. Sedan skulle han systematiskt blockera expression av proteiner som normalt uttrycks i dessa celler och mäta redigeringsinducerad fluorescens för att bestämma vilka av dessa proteiner som påverkar prime-editeringen.
Genom att genomföra denna plan identifierade teamet 36 cellulära determinanter för prime-redigering, varav endast en – det lilla RNA-bindande proteinet La – främjade redigering.
"Även om det uppenbarligen inte är en normal funktion av La-proteinet att främja prime-redigering, visade våra experiment att det avsevärt kan underlätta processen," sa Yan.
Inom celler är La känt för att binda specifika sekvenser som ofta finns i ändarna av begynnande små RNA-molekyler och det skyddar dessa RNA från nedbrytning. Princeton-teamet insåg direkt att de pegRNA som användes i Yans första experiment sannolikt innehöll de exakta sekvenserna, kallade polyuridinkanaler, eftersom de är en typisk men ofta förbisedd biprodukt av pegRNA-uttryck i celler. Efterföljande experiment antydde att sådana pegRNA oavsiktligt utnyttjar Las ändbindande aktivitet för skydd och för att främja prime redigering.
Motiverade av sina resultat frågade teamet om en sammansmältning av den del av La som binder polyuridinområdena till ett standardprotein för prime-redigering skulle kunna öka prime-redigeringseffektiviteten. De var glada över att finna att det resulterande proteinet, som de kallar PE7, avsevärt förbättrade den avsedda prime-redigeringseffektiviteten över förhållanden och, när de använde vissa prime-redigeringssystem, lämnade frekvensen av oönskade biprodukter mycket låga.
Deras resultat uppmärksammade snabbt kollegor som var intresserade av att använda prime redigering i primära mänskliga celler, inklusive Daniel Bauer vid Boston Children's Hospital och Harvard Medical School och Alexander Marson vid University of California, San Francisco. Tillsammans med forskare från dessa laboratorier fortsatte forskargruppen att demonstrera att PE7 också kan förbättra den bästa redigeringseffektiviteten i terapeutiskt relevanta celltyper, vilket ger utökade löften för framtida kliniska tillämpningar.
"Detta arbete är ett vackert exempel på hur djupgående undersökningar av cellers inre funktion kan leda till oväntade insikter som kan ge biomedicinsk effekt på kort sikt," konstaterade Bauer.
Mer information: Jun Yan et al, Förbättring av prime-redigering med ett endogent litet RNA-bindande protein, Nature (2024). DOI:10.1038/s41586-024-07259-6
Journalinformation: Natur
Tillhandahålls av Princeton University
