19 F NMR-baserad metod för Arf6 GEF-aktivitetsdetektion. Kredit:Wu Bo
En forskargrupp ledd av prof. Wang Junfeng från Hefei Institutes of Physical Science (HFIPS) vid den kinesiska vetenskapsakademin (CAS) har utvecklat en ny endimensionell (1D) fluor-19 ( 19 F) kärnmagnetisk resonans (NMR)-baserad metod för snabb detektion av Arf6 guanin nukleotid utbytesfaktor (GEF) aktivitet.
Deras resultat publicerades i Analytical Chemistry den 6 juni.
Små GTPaser (sGTPas) är involverade i signalkaskader som styr ett brett spektrum av cellulära svar. Alla sGTPaser kan hittas i två tillstånd:ett inaktivt tillstånd där det lilla GTPaset är bundet till guanosindifosfat (GDP), och ett aktivt tillstånd där det är bundet till guanosintrifosfat (GTP). GTPas-cykeln som bildas av interkonverteringen mellan de två tillstånden är strikt reglerad av guanin-nukleotidutbytesfaktorer (GEF) och GTPas-aktiverande proteiner (GAP).
Mutation eller onormal reglering av sGTPas-proteiner eller deras respektive GEF/GAP är nära besläktade med många sjukdomar inklusive cancer. Därför är det viktigt att detektera aktiviteten hos dessa GEF/GAP-proteiner både in vitro och in vivo.
I denna studie inkorporerade forskarna den onaturliga aminosyran tfmF platsspecifikt i Phe47 av sGTPase Arf6, en position belägen i ARF6-växlingsdomänen vars konformation förändras mest under GTPase-cykeln. Och de utvecklade 1D 19 F NMR-baserad metod för att detektera GEF-aktivitet i renat proteinsystem eller i närvaro av cellysat.
För en GEF-aktivitetsanalys sattes provet av GDP-laddat Arf6-F47 tfmF in i spektrometern så snart som möjligt efter tillsats av en GEF och GTP. En sekventiell serie av 1D 19 F-NMR-spektra uppsamlades. Signalen för Arf6-F47 tfmF i det GTP-bundna tillståndet bearbetades och integrerades. De kinetiska utbyteskurvorna plottades sedan och anpassades till en enfas exponentiell tillväxtkurva för att extrahera hastigheten.
"Denna strategi skulle potentiellt kunna användas för att övervaka konformationsförändringar av Arf6 eller andra sGTPaser," sade Wu Bo, första författare till studien, "den kan upptäcka aktiviteterna hos sGTPases regulatoriska proteiner i fysiologiska och patologiska miljöer." + Utforska vidare
