En forskargrupp har konstruerat mångsidiga genetiska verktyg för Saccharolobus islandicus REY15A, en av mycket få arkeala modeller för arkeabiologi och CRISPR-biologi.
Sådana verktyg inkluderar effektiv genomredigering, robusta proteinuttryckssystem, interferensplasmidanalys, gentystnad och CRISPR-baserad genredigering. Ändå är plasmidvektorer konstruerade för denna crenarchaeon hittills enbart baserade på den kryptiska pRN2-plasmiden.
Studien, som visas i mLife , leddes av Prof. Qunxin She och Dr. Guanhua Yuan, båda från Shandong University i Qingdao, Kina.
"Ett dubbelt värdvektorsystem krävs för att berika den genetiska verktygslådan för denna arkeonmodell", säger Prof. She.
Faktum är att i ett tidigt skede av arkeal vektorutveckling, både pRN1- och pRN2-plasmider som samexisterar i Sa. islandicus REN1H1 användes för att konstruera skyttelvektorer för Sa. islandicus REY15A baserat på dessa två plasmider; pRN2-härledda plasmider fick en hög transformationshastighet och gav verkliga transformanter, medan pRN1-baserade vektorer endast gav mycket få kolonier från vilka plasmider uppenbarligen saknades.
"Eftersom CRISPR-arrayer ofta har spacers som matchar olika plasmider i Sulfolobales, misstänkte vi att genomet av Sa. islandicus REY15A kan bära en spacer som matchar en sekvens i pRN1 men inte i pRN2", säger Dr. Yuan.
Efter bestämning av den fullständiga genomsekvensen av Sa. islandicus REY15A4, bär värdgenomet en spacer (L2S56) som endast visar två felmatchningar till ett DNA-segment (Target N1) i den kodande sekvensen för pRN1-replikasgenen. Transformationseffektivitetsexperiment visade att L2S56 crRNA uttrycktes till en nivå som kunde vara tillräcklig för att framkalla I-A-immuniteten men otillräcklig för att utlösa III-B-immuniteten för plasmideliminering i Sa. islandicus REY15A.
För att erhålla ett funktionellt mål-N1-derivat som undviker värdens CRISPR-immunitet designade teamet tre DNA-segment (N1a, N1b och N1c) baserat på pRN1-målet, medan de designade mutationerna i N1a var synonyma, N1b och N1c hade missense-mutationer. Resultaten visade att inget av de tre muterade målen var målinriktade av CRISPR-systemet i den arkeala värden. Efterföljande experiment visade dock att N1c bär på missense-mutationerna som kan ha inaktiverat replikationsproteinet.
Genom konstruktionen av en serie vektorer, Saccharolobus–E. coli-skyttelvektor pN1dAA med N1a-mutationer, argD-selektionsmarkör, p15A-replikationsstart och en kanamycin-resistent markör designades baserat på pRN1-ryggraden, vilket kan uppnå en stabil samexistens med den pRN2-härledda plasmiden pSeSD i Sa. islandicus REY15A-celler. Detta gav ett dubbelt plasmidsystem för genetiska studier med denna viktiga arkeala modell.
Eftersom undersökning av värd-plasmid-konflikter ger ett användbart sätt för identifiering av kompatibla plasmid-vektorsystem, när konflikten väl har lösts experimentellt, är de konstruerade plasmiderna mycket användbara för att utveckla värd-vektorsystem, som rapporterats i denna artikel.
Mer information: Pengpeng Zhao et al, Rationell design av obegränsade pRN1-derivat och deras tillämpning vid konstruktionen av ett dubbelt plasmidvektorsystem för Saccharolobus islandicus, mLife (2024). DOI:10.1002/mlf2.12107
Tillhandahålls av Tsinghua University Press
