* Begränsningsenzymer: Dessa enzymer fungerar som molekylär sax och skär DNA vid specifika sekvenser. De är avgörande för att skapa kompatibla ändar på plasmiden och genen av intresse.
* ligas: Detta enzym fungerar som molekyllim och förenar sig i plasmidens skurna ändar och genen och bildar en rekombinant plasmid.
Låt oss bryta ner processen:
1. Begränsning av digest: Plasmiden och genen av intresse skärs med samma begränsningsenzym. Detta skapar kompatibla klibbiga ändar, som är korta, enkelsträngade överhäng som kan baspar med varandra.
2. ligering: Den skurna plasmiden och genen blandas tillsammans med ligasenzym. Ligaset förenar de klibbiga ändarna och bildar en cirkulär plasmid som innehåller den nya genen.
Andra viktiga enzymer:
* DNA -polymeras: Detta enzym kan användas för att fylla i luckor i DNA, särskilt om restriktionsmältningen skapar trubbiga ändar (utan klibbiga överhäng).
* alkaliskt fosfatas: Detta enzym kan användas för att förhindra självlighering av plasmiden, vilket kan hända om plasmiden skärs med endast ett begränsningsenzym.
Sammanfattningsvis: Kombinationen av restriktionsenzymer och ligas är de viktigaste spelarna för att sätta in en ny gen i en plasmid. Andra enzymer kan användas beroende på de specifika detaljerna i kloningsprocessen.
