Av Andy Pasquesi
Uppdaterad 30 augusti 2022
Enzymer påskyndar kemiska reaktioner genom att sänka den aktiveringsenergi som krävs för substratomvandling. Omsättningsnumret, kcat , kvantifierar den katalytiska effektiviteten för ett enzym genom att mäta antalet substratmolekyler som omvandlas till produkt per enzymaktivt ställe per sekund under mättande substratförhållanden.
Rita produktkoncentrationen mot tiden för det första provröret i din enzymatiska analys. Använd tid på den horisontella axeln och produktkoncentration på den vertikala axeln.
Beräkna lutningen för den linjära delen av kurvan (initialhastighet, V0 ). I Excel eller en grafräknare ger den linjära regressionslinjen dig lutningen direkt. Om du föredrar en manuell uppskattning, dividera förändringen i produktkoncentration mellan två på varandra följande datapunkter med motsvarande förändring i tid.
Anteckna denna lutning som den initiala reaktionshastigheten, V0 , för det provröret. I regressionsekvationen [Product] = m·time + b , koefficienten m är V0 .
Upprepa steg 1–3 för varje provrör i analysen för att få en serie V0 värden vid olika substratkoncentrationer.
Skapa en Lineweaver–Burk (dubbel ömsesidig) plot:plot 1/[S] (omvänd substratkoncentration) på den horisontella axeln och 1/V0 (invers initial hastighet) på den vertikala axeln. Till exempel, om ett provrör har en initial substratkoncentration på 50 µM och en V0 på 80 µMs
–1
, skulle den plottade punkten vara (1/50 µM, 1/80 µMs
–1
).
Utför en linjär regression på dessa punkter. Den resulterande ekvationen har formen 1/V0 = m·(1/[S]) + b , där b är y-skärningen.
Beräkna inversen av Vmax genom att ta den reciproka av y-avsnittet:1/Vmax = 1/b .
Invertera värdet från steg 3 för att få Vmax :
Vmax = 1/(1/Vmax) = b
Identifiera enzymkoncentrationen som används i analysen (detta värde är konstant över alla provrör och bör rapporteras i rådata).
Beräkna kcat genom att dividera Vmax av enzymkoncentrationen:
kcat = Vmax / [E]
Detta ger antalet substratmolekyler som omvandlas per enzymaktivt ställe per sekund.
Genom att följa dessa systematiska steg – mäta initiala hastigheter, konstruera en Lineweaver–Burk-plot, extrahera Vmax , och normalisera till enzymkoncentration – du kan exakt bestämma ett enzyms omsättningstal, kcat , ett hörnstensmått inom enzymologi och läkemedelsutveckling.
